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用蛋白胨培养蛹虫草的方法

时间:2021-11-23 16:52:09 点击:42次

    蛹虫草为一种珍贵的食用和药用真菌, 由于此菌含有冬虫夏草菌素、色氨酸、胍氨酸氨基腺甙、吲哚乙酸和氨茴酸等物质, 在临床上被广泛应用于治疗肺结核、贫血虚弱、止血化痰、补精髓等, 虫草菌素的抗癌功能也早已被国内外所证实。 野生蛹虫草远远满足不了医药市场的需要, 因此, 人工培养蛹虫草的研究具有重要意义。 本文研究了几种人工培育蛹虫草的方法, 而且发现蛹虫草含广谱抗菌物质。


    柞蚕活蛹培育蛹虫草


    材料:供试菌株 采用中国药用真菌研究所提供的蛹虫草菌。


    柞蚕活蛹 吉林省桑蚕研究所提供。


    方法:蛹虫草菌母种培养 将原种接种于 PDA 培养基上, 24 e 温箱培养 2 周, 生长表现为菌丝纯白、浓密、健壮。


    液体菌种培养 液体培养基为 20 %马铃薯汁 1 L, 葡萄糖 20 g, K2HPO 4 3 g, Mg SO 4#7H 2O3 g,VB1 微量。 250 mL 锥形瓶内装 100 mL 培养液, pH5——7, 以03 @ 104 Pa 蒸气压力灭菌 30 m in。 冷却后常规接种, 静置 12 h 后, 于 24 e , 120 r/ min 振荡培养 6 d, 培养液呈混浊状态, 微浅褐色, 有明显菌丝球。


    蛹体消毒、接种 用 70 % 乙醇或 0.1% 新洁尔灭溶液将柞蚕蛹浸泡洗涤 2——3 min, 再用无菌水充分冲洗 2 次, 在无菌条件下, 用无菌注射器抽吸菌液, 从蛹体的环节间膜处将菌液注入蛹体。 每一蛹体注射 3——4 m L, 然后将蛹体置于无菌罐头瓶内,以灭过菌的双层牛皮纸封口。


    蛹虫草培养 培养室预先经过熏蒸灭菌, 将上述罐 头 瓶置于培养室内, 室内温度控制 在23——25 e , 空气相对湿度为50% , 黑暗避光, 培养25——30d。 此为第1阶段。 第2阶段温度调控在20——23 e , 室内空气相对湿度在70%——80%, 白天有散射自然光线, 从蛹体环节间膜处渐渐伸出菌丝,菌丝颜色从白色渐渐转为橙黄色, 这一阶段为 20 d左右。 第 3 阶段, 当蛹体外菌丝全部转为橙黄色, 并且包围住蛹体时, 将室内温度控制在 16——21 e 之间, 室内空气相对湿度控制在 80 % ——85 % 之间, 白天有自然散射光, 封口的牛皮纸要松开, 室内定时通风换气, 约 15 d 后, 形成子座。


    结果:培养出的子座呈橙黄到橙红色, 多数为单生, 从蛹体的头部、胸部、近腹部伸出, 不分枝或偶有分枝。子座全长为 3——10 cm, 基部 0. 5——1 cm, 头部棒形膨大略呈长纺锤体形, 顶端钝圆, 与野生蛹虫草形态相同。 一枚蛹体上可形成 1 至数个子座。在整个培养过程中, 室内空气相对湿度的控制至关重要。 在子座形成期, 即第 3 个阶段, 如果通气差, 则形成猴头状的子座; 如果光线弱, 则形成的子座颜色浅淡, 并且细弱。 因此, 环境条件控制恰当与否, 直接影响子座的形成与质量。


    米饭培养基培养蛹虫草


    所用菌株同柞蚕活蛹培育蛹虫草


    米饭培养基设计为 4 种,在500 mL的罐头瓶内盛米为5cm 高度。葡萄糖、蛋白质、蚕蛹粉或酵母粉按表 1 中含量溶于 1 L 水中, 充分溶解, 再注入罐头瓶中, 高度以超过米的高度的 1 倍为宜。 然后以双层牛皮纸封口,以     03 @ 104 Pa 蒸气压力灭菌 30 min。表 1 4 种米饭培养基配方( g/ L)


编号 米 葡萄糖/ g 蛋白胨/ g 蚕蛹粉/ g 酵母粉/ g


1 大米 10 10 10 0


2 大米 10 10 0 10


3 小米 10 10 10 0


4 小米 10 10 0 10


    待培养基冷却至 25 e 时, 于无菌条件下迅速挑取 1 块母种接入瓶中, 封口。

蛋白胨培养蛹虫草

    培养管理:培养室预先熏蒸灭菌。 第 1 阶段温度控制在23——25 e , 室内空气相对湿度为 65 % ——70 % , 不需光线或有微弱光线。 菌丝蔓延生长, 初为白色, 后逐渐转为黄色。 这一阶段约为 25 d。 第 2 阶段将温度降至 ( 18 ? 1) e , 室内空气相对湿度控制在75 %——85 % , 定时通风, 有散射光线照射, 10 d 后菌丝转为橙红色, 松开纸盖。


    培养结果:第 1 种培养基上长出子座原基, 渐长高, 顶部逐渐膨大成长纺锤体状, 顶端钝圆, 长约 3——5 cm,基部直径为 0. 5——1 cm, 颜色橙红, 与天然蛹虫草子座形态相似。 这一阶段需 7 d 左右。 第 2 种培养基上形成的子座较细弱, 颜色为橙黄色。 第 3 种培养基上不出现子座, 只有橙红色菌丝结块。 第 4 种培养基上也不出现子座, 只有橙黄色菌丝结块。 第 2,4 种培养基上蛹虫草菌丝颜色稍淡。




    用棉籽壳、玉米芯、葵花盘等培养蛹虫草


    设计 3 种培养基, 配方如下( 质量分数, % ) :


    棉籽壳 10, 白糖 0. 1, 麦麸 0, 石膏粉 0. 1  玉米芯( 粉碎) 8, 白糖 0. 1, 麦麸 2, 石膏粉 0. 1。 葵花盘( 粉碎) 6, 白糖 0. 1, 麦麸 4, 石膏粉 0. 1。


    上述 3 种培养基, 使其含水量均为 65 %, 装瓶后, 用双层报纸封口, 以03 @ 104 Pa 压力蒸气灭菌 1 h。 冷却后常规接以斜面母种。


    培养:第一阶段置于温度为 23 e 温箱中培养, 20 d后, 菌丝全部布满培养基, 菌丝白色。 然后转移至温度为 ( 20 ? 1) e 、空气相对湿度为 70 % ——80 % 的室内, 有散射自然光照射, 定时通风, 纸盖松开, 继续培养, 未有转色现象, 也不形成子座。 5——8 d 后, 菌丝逐渐自溶。


    杀菌、抑菌试验:将罐头瓶中的上述 3 种菌丝自溶后的培养基块在无菌条件下置于盛牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 1 号培养基、查氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基的培养皿中, 再分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌于牛肉膏蛋白胨培养基的皿中, 将 5406 产生菌接种于盛有高氏 1 号培养基的皿中, 将曲霉接入盛有查氏培养基的皿中, 将啤酒酵母接入盛有马铃薯葡萄糖培养基的皿中, 分别置于 37 e , 28 e 温箱中培养 3——7 d。 培养结果未见任何菌落产生。


    柞蚕蛹体大, 营养充足, 用其培养蛹虫草, 控制好不同阶段的条件因素, 特别是温度和光线, 长出的子座和天然蛹虫草子座形态相同。


    用大米饭培养基同样也可以培育出蛹虫草子座, 培养基中含有蚕蛹粉时, 长出的子座大, 呈橙红色, 与天然蛹虫草子座相似, 此法较经济易行。


    试验中用棉籽壳、玉米芯、葵花盘等培养基培养蛹虫草菌丝, 可得到广谱杀菌抑菌物质, 还需作进一步深入细致的分析研究。


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